(一)醋酸纖維素薄膜電泳

　　醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙�；�形成的纖維素醋酸酯。由該物質制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因為膜的親水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5靏的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。

　　醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。

　�、辈牧吓c試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液，濃度在0.05-0.09mol/L。

　�、膊僮饕�點

　�、拍さ念A處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液，不可吸得過干。

　�、萍訕樱簶悠酚昧恳罉悠窛舛�、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規(guī)電泳分析，每cm加樣線不超過1靗，相當于60-80靏的蛋白質。

　　⑶電泳：可在室溫下進行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。

　�、热旧�：一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。

　�、擅撋�與透明：對水溶性染料最普遍應用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定，可浸入冰醋酸：無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。

　　(二)凝膠電泳

　　以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍用于分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應用較廣，介紹如下：

　　⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結構單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的檢測。

　�、箔傊�糖凝膠電泳分離核酸的基本技術在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比;分子構型也對遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA>直線DNA>開環(huán)雙鏈DNA。當凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA(球形)不能進入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA(剛性棒狀)可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0。

　�、旁O備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應用比較廣泛。核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有TBE(0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA)和THE(0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA)。

　�、颇�膠制備：用上述緩沖液配制0.5%-0.8%瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5靏/ml，然后將其注入玻璃板或有機玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。

　�、菢悠分苽渑c加樣：溶解于TBE或THE內的樣品應含指示染料(0.025%溴酚藍或桔黃橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%)，也可使用2.5%Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10靏。

　�、入娪荆阂话汶妷簽�5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行。

　�、蓸悠坊厥眨弘娪窘Y束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠，將其裝入透析袋(內含適量新鮮電泳緩沖液)，扎緊透析袋后，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中，100V電泳2-3小時，然后正負電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含DNA的溶液，進行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收。其它還有低融點瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利于小分子量DNA片段(<1kb)的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。

　　(三)等電聚焦電泳技術

　　等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。

　　⒈IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點(pl)。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止�？梢娫谠摲椒ㄖ�，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區(qū)帶。

　�、瞤H梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區(qū)域內。由于兩性電解質具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區(qū)域內介質的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由于pI2>pI1，因此定位于第一種兩性電解質之后，這樣，經過一定時間后，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。

　�、硟尚噪娊赓|載體與支持介質理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩沖能力及電導，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導系數(shù)從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易于應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發(fā)生反應或使之變性。

　　常用的pH梯度支持介質有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應用。

　　電泳后，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合，因此應先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質，然后再以適當?shù)姆椒ㄈ旧��?

　　(四)其他電泳技術

　�、盜EF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳(管柱狀)為第一向，SDS-PAGE為第二向(平板)。在進行第一向IEF電泳時，電泳體系中應加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白質樣品中除含有這兩種物質外還應有二硫蘇糖醇以促使蛋白質變性和肽鏈舒展。

　　IEF電泳結束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應用的樣品處理液(內含SDS、-巰基乙醇)中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進行第二向電泳。

　　IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質(包括核糖體蛋白、組蛋白等)的分離是極為精細的，因此特別適合于分離細菌或細胞中復雜的蛋白質組分。

　�、裁�細管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右，然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并用毛細管加蛋白質溶液(0.1-1.0靗，濃度為1-3mg/ml)于凝膠上，毛細管的空隙用電極緩沖液注滿，切除插入粘土部分，即可電泳。

　　目前毛細管電泳分析儀的誕生，特別是美國生物系統(tǒng)公司的高效電泳色譜儀為DNA片段、蛋白質及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分，通過一個連機檢測器，將結果顯示并打印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率，生物相容性的優(yōu)點，又可方便地連續(xù)洗脫樣品。